滑石粉微生物学检验方法

1  主题内容与适用范围      本标准规定了滑石粉的微生物学检验方法及范围。     本标准适用于医药、食品及化妆品用滑石粉的微生物学检验。  2  术语      菌落总数：指样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落  总数。  3  检验通则  3.1  取样及注意事项 3.1.1  每批滑石粉应随机抽两个或两个以上包装完好的单位，试样量不少于10g，以使检验  结果具有代表性。 3.1.2  凡异常的供试品，则选取有疑问的样品进行检验。凡包装开户可见霉变的、无须检  验即可判为不合格。 3.1.3  在检验前，应严格保持包装的原有状态，防止再污染。并放在阴凉干燥处。防止因  微生物再繁殖而影响检验结果。凡原包装已启开，则无代表性。 3.1.4  样品的稀释，须在1～2h内完成，以防止微生物繁殖或死亡。 3.1.5  微生物检验全过程，必须在无菌操作条件下进行，凡直接与样品接触的用具，均应  事先灭菌并保持无菌。 3.1.6  从样品检出致病菌的报告发出之日起，该菌菌种需保存一个月备查，阴性样品可及  时处理。 3.2  供试液制备的材料和仪器     a.  天平：感量0.1g；     b.  三角烧瓶：300mL或500mL；     c.  玻璃珠：φ5mm；     d.  量筒：100mL；     e.  电炉；     f.  高压消毒锅；     g.  滤纸。 3.3  供试液的制备方法     称10g试样，放入装有90mL稀释剂(生理盐水)和十几个玻璃珠的三角烧瓶中，经振摇制  成1∶10的试液备用。取用时必须混匀。 3.4  阳性菌株对照试验 3.4.1  每次检验，应同时进行阳性对照生长试验。 3.4.2  对照试验加入的已知活菌量，每批样品应控制在50～100个范围之内。 3.4.3  常用的阳性对照菌株，卫生部检定所编号：大肠杆菌44102、绿脓杆菌10104、金黄  色葡萄球菌26003等。 3.4.4  作阳性菌株对照试验时，应注意安全，严格防止对照菌污染样品和环境。  4  细菌总数测定方法  4.1  方法原理     每种细菌有它一定的生理特性、生长时对营养、温度、时间、pH、需氧性等的要求均不  相同。在实际培养中，不可能同时满足所有细菌的要求，因此只能测定在营养琼脂上发育的  嗜中温性需氧及兼性厌氧的细菌菌落总数。 4.2  材料和仪器     a.  恒温培养箱；         b.  电热恒温水锅；     c.  移液管：1mL及10mL；     d.  平皿：φ90mm；     e.  试管：18mm×200mm     f.  试管架；     g.  放大镜。 4.3  培养基和试剂     a.  营养琼脂培养基；     b.  生理盐水：定量分装于试管(每支试管内9mL)。 4.4  试验程序                                       1∶10试液                                         ↓                                做几个连续倍数的稀释液                                         ↓                       选择2～3个连续稀释度，各加1mL于相应平皿                                         ↓                               平皿加入12～15mL营养琼脂                                  36±1℃↓48±2h                                    菌 落 计 数  4.5  试验步骤 4.5.1  试液稀释及培养 4.5.1.1  用1mL移液管取1∶10试液1mL，沿管壁加入盛有9mL盐水的试管(管的尖端不要触及  液面)，振摇试管，作成1∶100均匀稀释液。 4.5.1.2  另取1mL移液管，按上述(4.5.1.1)操作制10倍递增稀释液，每次更换一支移液管  ，稀释至10[-3]～10[-5]倍。 4.5.1.3  选择2～3个连续稀释度，用吸取该稀释度的移液管，移1mL试液于平皿内，每个稀  释度作2～3个平皿。 4.5.1.4  将预先放在45±1℃恒温水浴中的营养琼脂培养基，加入平皿约15mL，并转动平皿  混合均匀。同时再将营养琼脂15mL倾斜加入装有1mL不含试样的稀释剂平皿中，作为空白对  照。 4.5.1.5  琼脂凝固后，翻转平皿，置36±1℃培养箱内，48±2h取出进行菌落计数。平皿菌  落数乘以稀释倍数，即为每克样品所含菌落总数。 4.5.2  计数方法 4.5.2.1  用肉眼观察，必要时用放大镜。 4.5.2.2  求出同一稀释度各平皿的菌落平均值。若平皿中有连成大片的菌落生长，该平皿  不宜计数。若片状菌落不到平皿的一半，其余一半的分布又很均匀，可将此半个计数后乘以  2，代表全皿。 4.5.2.3  选择平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数的测定范围。当只有一个稀  释度符合此范围，即以该平皿菌落数乘以稀释倍数(见下表中例1)。 4.5.2.4  有两个稀释度，平均菌落数均在30～300之间，则应求出两者菌落总数之比值决定  。小于或等于2，报告其平均数；大于2则报告其中较小的菌落数(见下表中例2及例3)。 4.5.2.5  所有稀释度，其平均菌落均大于300个，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍  数(见下表中例4)。 4.5.2.6  所有稀释度的平均菌落均小于30个，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(  见下表中例5)。 4.5.2.7  所有稀释度的平均菌落均不在30～300个之间，则以最接近30或300的乘以稀释倍   数(见下表例6)。 4.5.2.8  所有稀释度均无菌落生长，为每克小于10个。 4.5.3  报告     菌落数在100以内，按实数值报告；大于100，采用二位有效数字乘以10的指数来表示，  有效数字后面的数值用修约法处理。以n/g为计量单位。                                细菌计数结果及报告方法 ________________________________________________________________________________               不同稀释度的平均菌落数        两稀释度      菌落总数      报告方式  例次           10[-1]      10[2]     10[3]      菌数之比        n/g            n/g ________________________________________________________________________________    1        1365       164        20           -           16400       1.6×10[4]    2        2760       295        46          1.6          38000       3.8×10[4]    3        2890       270        60          2.2          27100       2.7×10[4]    4       不可计     4650        513          -          513000       5.1×10[5]    5         27        11          5           -            270        2.7×10[2]    6       不可计      305         12          -          30500        3.1×10[4]  ________________________________________________________________________________   5  霉菌和酵母菌数测定方法  5.1  方法原理     真菌具有明显的细胞核，多数需氧，在偏酸含糖的培养基、较高湿度25～28℃的温度条  件下生产良好。本方法根据这些生物特性，进行培养和菌落计数。 5.2  材料和仪器     a.  恒温培养箱；     b.  振荡器；     c.  电热恒温水浴锅；     d.  试管：15mm×150mm；     e.  移液管：1mL和10mL；     f.  平皿：φ90mm；     g.  生物显微镜；     h.  载破片、盖破片。 5.3  培养基和试剂     a.  虎红琼脂培养基；     b.  蒸馏水：定量分装于试管(每支试管9mL)。 5.4  试验程序                                    1∶10试液                                       ↓振荡30min                             做几个连续倍数的稀释液                                       ↓                        选择3个连续稀释度，各加1mL于相应平皿                                       ↓                             每皿加入12～15mL培养基                               25～28℃↓72h                                  菌 落 计 数  5.5  试验步骤 5.5.1  试液稀释及培养 5.5.1.1  将1∶10试液置振荡器中，振荡30min，使霉菌孢子充分散开。 5.5.1.2  按细菌总数测定4.5.1.1～4.5.1.2中规定的稀释方法，稀释至10[-1]～10[-4]。 5.5.1.3  根据试样污染程度，选择3个连续稀释度，分别移1mL稀释液于相应平皿中。     每个稀释度做2～3个平甲。然后将预先放在水浴锅中的45±1℃的虎红琼脂培养基，分  别加入约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时按细菌总数测定中的方法，做空白对照。 5.5.1.4  待琼脂凝固后，倒置于25～28℃培养箱中，72±2h取出进行菌落计数。 5.5.2  计数方法     用肉眼观察，选择同一稀释度平均菌落数在5～50个之间的，乘以稀释倍数，作为霉菌  和酵母菌总数。计数和报告中所遇到的各种情况，按细菌总数测定4.5.2中的规则。     注：计数时，如不能肯定是霉菌和酵母菌，可取培养物涂片，直接镜检或革兰氏染色后  镜检。  6  大肠菌群、粪大肠菌群检验方法  6.1  方法原理     根据其所具有的生物学特性。如革兰氏阴性无芽胞杆菌，分别在37℃和44℃、24～48h  能发酵乳糖、产酸、产气，并能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质  等。 6.2  材料和仪器     a.  恒温培养箱；     b.  电热恒温水浴；     c.  试管及小倒管：15mm×150mm；     d.  移液管：1mL、10mL；     e.  平皿：φ90mm；     f.  pH试纸；     g.  生物显微镜；     h.  载破片和盖破片。 6.3  培养基和试剂     a.  乳糖胆盐培养基；     b.  伊红美兰琼脂(EMB)；     c.  革兰氏染色液；     d.  蛋白胨水；     e.  靛基质试剂；     f.  乳糖发酵培养基。 6.4  试验程序                                    1∶10试液                                       ↓                                做三个连续稀释度                                       ↓                                 乳糖胆盐发酵管                                36±1℃↓48h                             _________________________                            ↓                       ↓                      不产酸、不产气             产酸、产气                            ↓              ________________________                           阴性            ｜                      ｜                                     乳糖胆盐发酵管             证实试验                                       44℃↓～48h                 ↓                                    ________________          ____________                                   ↓              ↓        ↓          ↓                             不产酸、产气      产酸、产气  EMB平板    乳糖发酵                                   ↓              ↓                                  阴性     _________________                                          ↓               ↓                                     靛基质试验          EMB平板                                                      36±1℃↓24h                                                        梁色镜检 6.5  试验步骤 6.5.1  试液稀释 6.5.1.1  用1∶10试液，按细菌总数测定4.5.1.1～4.5.1.2中的方法做10倍递增稀释液。 6.5.1.2  根据样品的污染情况，选择三个连续稀释度。 6.5.2  大肠菌群 6.5.2.1  将试液分别接种于预先装有10mL乳糖胆盐培养基的试管内，每管1mL，每一稀释度  接种3管，置36±1℃培养48h，如所有试管内部不产酸，不产气，则可报告大肠菌群阴性。  如有产气、产酸者则需按6.5.2.2进一步做证实试验。 6.5.2.2  划线接种于EMB平皿，置36±1℃，培养18～24h，取出观察形态，挑取可疑菌落做  染色镜检，同时做乳糖发酵试验，凡乳管产气、镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，即可报告大  肠菌群阳性。 6.5.3  粪大肠菌群 6.5.3.1  将第一次产酸、产气的乳糖胆盐培养物，分别以1mL接种于各乳糖胆盐发酵管内，  置44±0.5℃水浴锅，培养24～28h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸，不产气，则可报告粪  大肠菌群阴性，如产酸、产气，则进行6.5.3.2～6.5.3.5程序。 6.5.3.2  划线接种于EMB平皿，置36±1℃，培养18～24h，同时接种于蛋白胨水，置44±0.  5℃培养24h。 6.5.3.3  经培养后，在EMB平皿上典型大肠菌群菌落，呈深紫黑色，圆形、边缘整齐，表面  光滑湿润。常见有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深  的菌落。 6.5.3.4  挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 6.5.3.5  在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂0.5mL，阳性反应则液面呈现玫瑰红色，阴  性反应液面呈试剂本色。 6.5.3.6  平皿上有典型菌落，经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则报告粪大  肠菌群阳性。  7  绿脓杆菌检验方法  7.1  方法原理     根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性，能产生绿脓菌素。此外还能  液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐。在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。 7.2  材料和仪器     a.  恒温培养箱；     b.  冰箱；     c.  三角烧瓶：500mL、300mL；     d.  试管：φ18mm×200mm；     e.  平皿：φ90mm；     f.  移液管：1mL、10mL；     g.  生物显微镜；     h.  载破片及盖破片；     i.  接种环及针；     j.  酒精灯； 7.3  培养基和试剂       a.  营养琼脂培养基(普通肉汤培养基)；     b.  十六烷三甲基溴化铵培养基；     c.  乙酰胺培养基；     d.  绿脓菌色素测定用培养基；     e.  明胶培养基；     f.  硝酸盐蛋白胨水培养基；     g.  1%的二甲基对苯二胺试液；     h.  三氯甲烷(氯仿)；     i.  1mol/L的盐酸。 7.4  试验程序                                   1∶10试液                                      ↓                              普通肉汤培养液，增菌                                  37℃↓18～24h                        十六烷三甲基溴化铵培养基、分离培养                                  37℃↓18～24h                            普通肉汤培养基、纯培养                                  37℃↓18～24h                             __________________________                            ↓                        ↓                         染色镜检                  生化试验                                             _________________                                            ↓               ↓                                            氧 绿 硝  产 明 42℃                                            化 脓 酸  气 胶  生                                            酶 菌 盐  试 液  长                                            试 素 还  验 化  试                                            验 试 原     试  验                                               验 产     验                                                  气                                                  试                                                  验  7.5  试验步骤 7.5.1  增菌：取1∶10试液10mL，放入装有90mL普通肉汤培养液的三角烧瓶中，在37℃下培  养18～24h，有绿浓菌生长时，培养液表面多有一层薄菌膜，且呈黄绿色或蓝绿色。 7.5.2  分离培养：挑取增菌培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平皿上(也可划线  接种在乙酰胺培养基上)。在37℃培养18～24h，在培养基上，菌落扁平无定型、呈灰白色。  向周边扩散或略有蔓延、表面湿润，周围的培养基常扩散有水溶性色素(在乙酰胺培养基上  ，菌落扁平、边缘不整齐，周围的培养基略带粉红色，而其他菌不生长)。 7.5.3  纯培养：挑取可凝绿脓杆菌的分离培养物菌落2～3个放入肉汤培养基，在37℃培养1  8～24h。 7.5.4  染色镜检：挑取可疑菌落、涂片、革兰氏染色，经镜检为阳性者，进行氧化酶试验  。 7.5.5  氧化酶试验；取一小块白色滤纸，放在平皿内，用玻璃棒挑取绿脓杆菌的可疑菌落  ，涂在滤纸上，加1滴新配制的二甲基对苯二胺试液(1%)，30s内出现粉红色或紫红色，为阳  性；若培养物不变色，氧化酶试验为阴性。 7.5.6  绿脓杆菌试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，在37℃培  养24h，加入氯仿3～5mL，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液  呈蓝色时，用移液管将氯仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右，振荡后静置片刻  。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，说明样品中有绿脓菌素存在。 7.5.7  硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐胨水培养基中，置37℃  培养24h，观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小试管中有气体者，为阳性。表明该菌能  还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氧气。 7.5.8  明胶液化试验：取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，在37  ℃培养24h，取出放入冰箱(0～4℃)10～30min，仍呈溶解状，为阳性凝固不溶解者为明胶液  化试验阴性。 7.5.9  42℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，在42±1℃，培养24  ～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性。 7.6  试验结果：试样经增菌、分离培养、证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验  均为阳性者，样品判为有绿脓杆菌；绿脓菌素试验阴性而液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃  生长试验皆为阳性时，仍判样品中有绿脓杆菌。  8  金黄色葡萄球菌检验方法  8.1  方法原理     根据本菌的特有形态及培养特性，应用Baird-parker平皿进行分离，该平皿中的氯化锂  可抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，提高检出率，并利用分  解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。 8.2  材料与仪器     a.  生物显微镜；     b.  恒温培养箱；     c.  离心机；     d.  移液管：1mL、10mL；     e.  试管：φ15mm×150mm；     f.  三角烧瓶：500mL或300mL；     g.  载破片、盖破片；     h.  接种环或针；     i.  酒精灯。 8.3  试剂和培养基     a.  7.5%的氯化钠肉汤；     b.  Baird-parker平皿；     c.  血琼脂培养平皿；     d.  甘露发酵培养基；     e.  盐水；     f.  血浆。 8.4  试验程序                                          1∶10试验                                       ↓                             7.5%的氯化钠肉汤、增菌                                36±1℃↓24h                           Brird-parker  平皿、分离培养                                36±1℃↓24～48h                               血琼脂平皿、纯培养                                36±1℃↓24h                          _____________________________                         ↓            ↓             ↓                      染色镜检   甘露醇发酵试验  血浆凝固酶试验  8.5  试验步骤 8.5.1  增菌：取1∶10试液10mL，放入装有90mL7.5%的氯化钠肉汤的三角烧瓶中，在36±1  ℃培养24～48h。Baird-parker平皿上有圆形光滑凸起，湿润直径为2～3mm，呈灰色到墨色  ，边缘色谈，周围呈一浑浊带，外层有一透明带。无Baird-parker培养基可划线接种在血琼  脂平皿上培养。血琼脂平皿上的菌落呈金黄色，大而突起，圆形不透明，表面光滑，周围有  溶血圈。 8.5.3  纯培养：从分离培养皿上，挑取单个疑似菌落接种于血琼脂平皿上，在36±1℃下培  养24h。 8.5.4  染色镜检：挑取纯培养的疑似菌落进行涂片和革兰氏染色、镜检。金黄色葡萄球菌  为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无牙胞，无荚膜。致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为  0.5～1μm。 8.5.5  甘露醇发酵试验；取纯培养菌落接种到甘露醇发酵培养基中，在36±1℃培养24h。  金黄色葡萄球菌能发酵甘露醇产酸，培养基呈红色。 8.5.6  血浆凝固酶试验：吸取1∶4的新鲜兔血浆0.5mL，放入试管，加入待检的增菌24h肉  汤培养物0.5mL。混匀后放入36±1℃的培养箱或水浴锅中，每半小时观察一次，24h之内呈  现凝块，为阳性。同时用已知血浆凝固酶试验阳性和阴性菌株，作为对照。 8.6  试验结果     上述选择平皿上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵  甘露醇产酸，血浆凝固酶试验阳性者，表明样品中有金黄色葡萄球菌。                                           附  录  A                              微生物学检验的有关培养基和试剂                                        (补充件)  A1  营养琼脂培养基(肉汤琼脂培养基)      a.  成分         蛋白胨     10g         氯化钠     5g         琼  脂     15g         牛肉膏     3g         蒸馏水     1 000mL     b.  制  法     将蛋白胨、氯化钠、琼脂、牛肉膏加到蒸馏水中，微温使溶，再加热煮沸，待琼脂完全  溶化后，混匀，用1mol/L NaOH溶液调pH值为7.4±0.2，过滤，分装于三角烧瓶，经121℃，  高压灭菌20min后，贮存0～4℃冷暗处备用。  A2  虎红琼脂培养基      a.  成  分         蛋白胨              5g         葡萄糖              10g         磷酸二氢钾          1g         硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g         琼  脂              20g         4/3000虎红水溶液    100mL         蒸馏水              900mL     b.  制  法     将上述(除虎红水溶液外)各成分，分别加于蒸馏水中，加热溶解，过滤，再加入虎红水  溶液(四氯四碘荧光素溶液)，同A1中b项分装后，在121℃高压灭菌20min。  A3  乳糖胆盐培养基      a.  成  分         蛋白胨               20g         猪胆盐               5g         乳  糖               5g         0.4%溴甲酚紫水溶液   2.5mL         蒸馏水               1 000mL     b.  制  法     将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH值为7.4，加入指示剂(0.4%溴甲酚紫水溶  液)混匀，分装于有小倒管的试管中(见A12中b项)，置于115℃高压灭菌20min。  A4  伊红美兰(EMB)琼脂      a.  成  分         蛋白胨             10g         乳  糖             10g         磷酸二氢钾         2g         琼  脂             20g         2%伊红水溶液       20mL         0.5%美兰水溶液     13mL         蒸馏水             1 000mL       b.  制  法     先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸二氢钾、蛋白胨混匀，使之溶  解，再以蒸馏水补足至1 000mL，调pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，在121℃高压火菌15mi  n后备用。用时，加入乳糖并加热融化琼脂，在60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红、美兰  溶液，摇匀，倾注平皿使用。  A5  蛋白胨水      a.  成  分         蛋白胨   20g         氯化钠   5g         蒸馏水   1 000mL     b.  制  法     将上述成分加热熔化，调pH值为7.0～7.2，分装小试管，经121℃高压灭菌15min。  A6  靛基质试剂(柯凡克试剂)       a.  成  分         戊  醇            75mL         对二甲氨基苯甲醛  5g         浓盐酸            25mL     b.  制  法     将对二甲氨基苯甲醛加入戊醇中，搅动使之完全溶解，然后1滴1滴缓慢地加入盐酸25mL  。  A7  革兰氏染色液  A7.1  染液制备 A7.1.1  结晶紫染色液     a.  成  分         结晶紫             1g         95%乙醇            20mL         1%草酸铵水溶液     80mL     b.  制  法     将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸溶液混合。 A7.1.2  革兰氏碘液     a.  成  分         碘            1g         磺化钾        2g         蒸馏水        300mL     b.  制  法     将碘与碘化钾进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至30  0mL。 A7.1.3  脱色液：95%乙醇 A7.1.4  复染液 A7.1.4.1  沙黄复染液     a.  成  分         沙  黄             0.25g         95%乙醇            10mL         蒸馏水             90mL     b.  制  备     将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A7.1.4.2  稀石炭酸复红液     a.  成  分         碱性复红              10g(研细)  第一步         95%乙醇               100mL         5%石炭酸水溶液        90mL       第二步         蒸馏水                90mL     b.  制  法     将碱性复红加入乙醇，放约12h，过滤。取该溶液10mL，加入5%石炭酸水溶液，混合；  再取此液10mL加入蒸馏水，即为(1∶10)稀石碳酸复红液。 A7.2  染色法 A7.2.1  将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。 A7.2.2  滴加革兰氏碘液，作用min，水洗。 A7.2.3  滴加95%乙醇脱色，约30s。 A7.2.4  滴加复染液(沙黄)，复染1min，水洗，待干，镜检(注：用稀石炭酸复红液复染，  仅需10s)。 A7.3  染色结果     革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。  A8  十六烷三甲基溴化铵培养基      a.  成  分         牛肉膏              3g         蛋白胨              10g         氯化钠              5g         十六烷三甲基溴化铵  0.3g         琼  脂              20g         蒸馏水              1 000mL     b.  制  备     将除琼脂外的其他成分混合，加热溶解，调pH值为7.4～7.6，加入琼脂，经115℃高压  灭菌20min后，制成平皿备用。  A9  乙酰胺培养基      a.  成  分         乙酰胺                10g         氯化钠                5g         无水磷酸氢二钾        1.39g         无水磷酸二氢钾        0.73g         硫酸镁(MgSO4·7H2O)   0.5g         酚  红                0.012g         琼  脂                20g         蒸馏水                1 000mL     b.  制  法     除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解调pH值为7.2，加入琼脂、酚红  经121℃高压灭菌20min后，制成平皿备用。  A10  绿脓菌色素测定用培养基      a.  成  分         蛋白胨                20g         氯化镁                1.4g         硫酸钾                10g         琼脂                  10g         丙三醇(甘油)(化学纯)  10g         蒸馏水                1 000mL     b.  制  法     将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使之溶解，调pH值为7.4，加入琼脂和  甘油，加热溶解，分装于试管内，115℃高压灭菌20min后，制成斜面备用。  A11  明胶培养基       a.  成  分         牛肉膏             3g         蛋白胨             5g         明  胶             120g          蒸馏水             1 000mL     b.  制  法     取各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使之溶解，调pH值为7.4，分装于试管  内，经115℃高压灭菌20min后，直立放置凝后备用。  A12  硝酸盐蛋白胨水培养基      a.  成  分         蛋白胨        10g         酵母浸膏      3g         硝酸钾        2g         亚硝酸钠      0.5g         蒸馏水        1 000mL     b.  制  法     将蛋白胨和酵母浸膏加到蒸馏水中，加温使之溶解，调pH值为7.2，煮沸过滤后补足液  量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，经115℃高压灭菌20m  in后备用。  A13  7.5%的氯化钠肉汤      a.  成  分         蛋白胨        10g         牛肉膏        3g         氯化钠        75g         蒸馏水        1 000mL     b.  制  法     将上述成分放入蒸馏水中加热溶解，调pH值为7.4，分装后经121℃高压灭菌15min。  A14  Baird-parker平皿      a.  成  分         胰蛋白胨            10g         牛肉膏              5g         酵母浸膏            1g         丙酮酸钠            10g         甘氨酸              12g         氯化锂(LiCl·6H2O)  5g         琼  脂              20g         蒸馏水              950mL     b.  制  法      将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃，调pH值为7.0±0.2。分装每瓶  95mL，经121℃高压灭菌15min。临用时，加热溶化，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾  增菌剂5mL，摇匀后倾注平皿。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱贮存不得超过48h(  注：增菌剂的配制：30%的卵黄生理盐水50mL，与除菌过滤1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存  于冰箱内)。  A15  血琼脂培养基      a.  成  分         营养琼脂            100mL         脱纤维兔血浆        10mL     b.  制  法      将营养琼脂加热溶化，待冷至50℃左右，以无菌手续加入脱纤维兔血浆，摇匀，制成平  皿，置冰箱内备用。     c.  血浆制备     取3.9%柠檬酸钠溶液(121℃灭菌30min)。每1份加入全血4份，混匀静置，2 000～3 000  r/min离心3～5min。血球下沉，取上面血浆。  A16  甘露醇发酵培养基      a.  成  分         蛋白胨                         10g         氯化钠                         5g         甘露醇                         10g         牛肉膏                         5g         0.2%溴麝香草酚蓝溶液(指示剂)   12mL         蒸馏水                         1 000mL     b.  制  法      将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH值为7.4，加入甘露醇和指  示剂，混匀后分装试管中，经115℃高压灭菌20min后备用。  A17  乳糖发酵培养基      a.  成  分         蛋白胨水                    2g         氯化钠                      3g         磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)  2g         0.4%溴麝香草酚蓝液(BTB)     6mL         乳  糖                      5g         蒸馏水                      1 000mL     b.  制  法      除乳糖和BTB外的其他成分，加在蒸馏水中，微湿溶解，调pH值为7.4，加入乳糖和BTB  ，混匀，分别装于有倒管的试管内，每管约5mL，经115℃高压灭菌20min后备用。                            ______________________      附加说明：     本标准由国家建筑材料工业局碱阳非金属矿研究所负责起草。     本标准主要起草人潘宇清。